知識天地

保存型與去活化型病毒檢體運送培養基的效能評估

2020.11.02

臨床上,病毒的感染需要進行診斷,才能提供醫師治療的依據、流行病學的訊息以及病毒感染的防治。病毒的實驗室診斷方法 包括以養殖細胞分離病毒、組織學、血清學、電子顯微鏡觀察、免疫分析以及核酸 (DNA 或 RNA)偵測等方法[1-2],操作這些方法前, 須從疑似病毒感染的患者適當的部位採集各 種檢體,並儘速運送至檢驗室進行實驗室診 斷[2]。病毒感染的診斷準確性受到各種因子。


影響:(i)檢體的採檢時機:檢體通常在症狀 出現後的 3 天內採檢;(ii)採檢部位的選擇: 如呼吸道感染,選擇利用拭子(swab)採集呼 吸道檢體;(iii) 檢體的方式:如採檢體液或 利用拭子採檢後放入無菌的空容器、小瓶(vi- als)或裝有液體運送培養基(transport   medium)的容器(如試管);(iv)採檢的拭子的本質:拭子的材質以植絨(flock)材質為佳[2-3],並具 有塑膠或鋁材質的硬柄或軟柄,不可使用木 柄的棉棒,因其對養殖細胞具有毒性;也不 可使用海藻酸鈣(calcium alginate)成分的拭 子,因其對含包膜 (envelope) 的病毒具有毒 性、並可幹擾螢光抗體試驗以及抑製一些核 酸物質而影響核酸的分子生物檢測;(v)檢體 的運送時間、儲存環境以及  (vi)   其它:如採集技術、採集的檢體量、檢體標示以及患者的臨床資訊等[1,3]。有些病毒感染的實驗室診斷是必要的, 例如檢測會引起嚴重症狀的病毒[如後天免疫 缺 乏 症 候 群 (acquired immune deficiency syndrome, AIDS)的愛滋病毒(HIV)]或是長期 的潛伏的病毒〔如長期潛伏於肝臟的 B 型肝 炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)和 C 型肝炎 病毒(Hepatitis C virus, HCV)J;或在短時 間內能快速傳播及引起高致死率的病毒,如:2003 年爆發流行的  SARS  病毒(SARS-CoV)[4]及 2019 年爆發流行的新型冠狀病毒(SARS- CoV-2,  COVID-19 病毒)[5]。此外,已經有 藥物可以治療的病毒感染,或為了流行病學 調查、醫院感染控製、公共衛生如隔離等目 的而進行檢體的採集並進行各類病毒的檢測。 病毒檢測檢體除了體液〔如支氣管肺泡 灌洗(BAL)、腦脊髓液(CSF)、尿、血液J外, 若以拭子採集的檢體需放入空的無菌容器或 含有運送培養基的容器內,立即以適當的條件送至檢驗室或儲存在適當的環境一段時間再送至檢驗室。因此,病毒檢測檢體中的抗 原、活性、病毒量與核酸將受到拭子的本質、運送培養基的成分、運送的條件、儲存的時 間與環境等之影響[1,3]。為了保存病毒的活性 以及核酸,檢驗室有必要使用良好品質與材 質的拭子以及適當的檢體運送培養基種類。

對少數引起嚴重疾病的病毒而言,檢測 病毒必須在 P2+或 P3 甚至 P4 等級的負壓實驗室中進行,以 SARS-CoV 及 SARS-CoV-2而言,更是如此。然而,有此些安全等級的 實驗室在醫院中並不普遍,因此,對高傳染 性的病毒而言,整體的檢驗能量將受到限製。 在 SARS-CoV-2 疫情期間,增加全國的檢測 能量以早期偵測感染或潛伏的患者將有其重 要性及必要性。對不進行病毒分離培養而僅 提供核酸擴增試驗的檢驗室而言,隻要檢測 檢體先經去活化   (inactivate,滅活)處理,則

檢測的場所僅需在 P2  等級的實驗室即可進行操作,如此,將可擴展全國對   SARS-CoV-2病毒的整體檢測能量。

在台灣,具有病毒檢測能力的檢驗室雖 有能力配製一般病毒檢體的運送培養基,但 其使用前大多未進行實用的效能評估或進行 效能的品管,且常沒有使用正確材質成分的 拭子,有鑑於此,做新生物科技公司開發兩 種病毒檢測檢體的運送裝置:一為 CMPTM 病 毒運送保存管[viral transport medium (VTM)],另一為 CMPTM 去活化型病毒運送保存管[in- activated  viral  transport  medium  (I-VTM)](圖 1A),兩者皆可搭配鼻咽及/或口咽植 絨拭子(flocked swab)。植絨拭子皆具有斷點 (圖 1B),可將拭子前端折進運送管內。為 了瞭解 VTM 與 I-VTM 輔助病毒(包含 SARA- CoV-2)偵測的效能,有必要以適當的病毒 進行實用性評估。

早期,對於運送檢體裝置的病毒回收率 並沒有標準的方法,隻有少數的研究從臨床上取得的檢體,經由不同運送裝置來比較病毒的回收率;或是添加某種病毒檢體至運送 裝置,檢視回收率。為了將運送培養裝置的評估加以標準化,Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M40-A2[6]提出明 確規範,包括病毒檢體的種類、運輸時間、 保存溫度及病毒接種濃度上限範間。在規範 中,將裝置保存在指定溫度,模擬運輸時間 (24、48、72   及   96   小時),再分別製備十倍連續稀釋液,吸取 0.2  mL 接種至養殖細胞中,若產生細胞病變效應(cytopathic effects, CPE),代表病毒具有活性,即運送裝置保存 病毒的性能符合規範之要求。

本研究將根據 CLSI 建議選用第二級病毒[6]之一的腸病毒 71 型(Entrovirus  71,  EV  71)進行測試,EV 71 屬於微小核糖核酸病毒科 (Picornaviridae),不具包模(envelope)的單股 正股 RNA 病毒,由於不具包膜,對於環境的耐受力較高[7],且其與冠狀病毒科(Coronavi-ridae)中的 SARS-CoV 與 SARS-CoV-2 皆屬 於 RNA 病毒[4-5]。實驗時,將 EV 71 分別與 VTM 或 I-VTM 兩種運送培養基混合,保存於 三種溫度,然後於不同指定時間後,分別接 種至人類橫紋肌肉瘤細胞(human rhabdomyos- arcoma cell , RD 細胞)中,之後觀察 CPE 及利用反轉錄-即時聚合醋鏈反應(quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)偵測 RD 細胞內 EV  71 之正股及負股 RNA,其中細胞內正股 RNA 代表 EV  71 成功感染細胞,而細胞內負股 RNA 則為 EV 71 複製其 RNA 的中 間產物,可間接證明 EV 71 於 RD 細胞內複 製。另外,本研究利用 SARS-CoV-2 的三對 基因[8-9]分別與 VTM 或 I-VTM 混合,亦進行 如同 EV 71 在不同保存溫度及時間條件下的 qRT-PCR 檢測,以了解此 VTM 及 I-VTM 保 存 SARS-CoV-2 核酸的能力。



非洲綠瀰猴腎細胞株 (vero cell line, ATCC CCL-81)及 EV 71 (BrCr, ATCC VR784)均購自食品工業發展研究所,台灣。SARS-CoV-2 的三對引子(primers)基因片段 (E gene、RdRp gene 及 N gene),購自 MicroBioLogics®(型 號:   HE0062S),USA。試劑與藥品一倍基本培養液 (1x minimal essential medium, MEM)與抗生素(antibiotic-antimycin, 內含 penicillin、streptomycin、amphotericin B)購自 Corning Incorporated 公司,美國。胎 牛血清(fetal bovine serum, FBS)、膜蛋白酵 素(Trypsin)與一倍磷酸鹽緩衝液(1x phosphate buffer saline, PBS)來自 GE Healthcare 公司, 美國。甘油(Glycerol)、氯仿(chloroform)、 75% 酒精 (EtOH)、異丙醇 (isopropanol) 與 DEPC (diethylpyrocarbonate)處理水從 Merck 公司(德國)取得。螢光定量試劑盒(FastStart Universal SYBR Green Master)則購自 Roche 公司,瑞士。而 cDNA 反轉錄試劑盒 (High- Capacity cDNA Reverse Transcription Kit)及 trizol(分離 RNA、DNA、蛋白質的試劑) 則來自 Thermo Fisher Scientific 公司,美國。

細胞培養液配製(10%  MEM、2%  MEM)取總體積 10%的 FBS 及 1%的抗生素的 加入 1x MEM,此為生長培養液(10% MEM), 存放於 4C用於細胞繼代及培養。取總體積 2%的 FBS 及 1%的抗生素加入 1x MEM,此 為維持培養液(2% MEM),存放於 4C用於稀 釋藥物及維持受病毒感染的細胞株。FBS 使 用前需在 56C水浴槽加熱 30 分鐘,去除血 清中補體,分裝後保存於-20C備用。將 10x PBS 利用去離子蒸餾水  (double-distilled H2O, ddH2O) 稀釋成 1x PBS,再經滅菌冷卻後存 放於 4C備用。此外,glycerol 則以 ddH2O 稀 釋成 30%   glycerol,再經滅菌冷卻後,存放於 4C備用。


        
RD  細胞培養/繼代培養

RD 細胞於培養瓶中生長至 80%時,進 行繼代培養。在無菌操作箱(型號:Revcoeite II)中,將經過培養的 T25 培養瓶(購自 Corning Incorporated 公司,美國)以 3 mL 1x PBS 潤洗後去除培養液,接著加入 0.5 mL Trypsin, 混合均勻後置入 37C之 5% CO2 培養箱中放 置 1 分鐘,取出培養瓶後以拍擊方式震散細 胞,然後加入 4.5 mL 10% MEM 以中和 Trypsin 的繼續作用,將 RD 細胞沖下並均勻 打散,接著將細胞與 10% MEM 以 1:4 至 1:9 的比例回種到新的細胞培養血中,置於 37C 之 5% CO2 培養箱培養。

EV  71 之溶斑試驗

利用溶斑試驗(plaque assay)測定 EV 71 濃度,實驗時,將 RD 細胞培養於 6 孔細胞 培養盤中,之後以 2% MEM 將待測病毒液進 行連續 10 倍稀釋後 (10-2-10-6)進行感染,其 中 1 孔為不加病毒液之陰性控製組,將細胞 置於 37C的 5% CO2 培養箱中 1 小時進行感 染。

於感染的過程中,配製等體積的 1.2%瓊 脂溶液與 2x 培養液,置於 44C水浴中。待病 毒感染完成後去除病毒液,將等體積之 1.2% 瓊脂溶液與 2x 培養液均勻混合後,分別於培 養盤中每一孔緩慢加入 4  mL 瓊脂培養液,待凝固後,置於 37C的 5% CO2 培養箱中,於3  天後加入第二層瓊脂,然後繼續培養。

當產生明顯 CPE 時(通常於感染後第 5 天),於每培養盤中每孔加入 1 ml 3.7%甲 醒,於 4C固定。隔天輕輕敲除 6 孔盤中的 瓊脂培養基,並加入 2-3 滴的 0.5%結晶紫,染色 5 分鐘後,以清水沖洗乾淨。當培養盤完全乾燥後,受到 EV  71 感染的 RD 細胞由 於死亡脫落而無法被染上色,形成肉眼可見的空洞,稱為溶斑(plaque)。藉由感染不同稀 釋倍數的病毒液所造成的溶斑數目推算原始 病毒的效價 (titer),單位為 plaque forming unit (PFU)/mL,代表每 mL 病毒液可產生的 病毒溶斑數目。


EV 71 RNA 之萃取

將 1.5 mL 含有 EV 71 的培養液於 4C下1,000 rpm,離心 5 分鐘,將上清液去除後加 入 1 mL 的 trizol 將沉澱物打散,將混合液移 至另一個 1.5  mL 微量離心管中,於室溫靜置 5 分鐘,接著加入 200 μL chloroform,利用 振盪器(vortex genie 2)震盪 1 分鐘,直至溶 液顏色變成粉紅色後,然後再於室溫靜置 2-3 分鐘。將離心管於 4C,12,000   rpm 離心 15

分鐘後,小心吸取上層含 RNA 之透明液(至少 450 μL)移至新的 1.5 mL 微量離心管中, 然後加入 0.5 mL isopropanol 後,上下搖晃 約 10 次,將溶液混合均勻後,靜置於室溫 10 分鐘,接著將離心管於 4C,12,000 rpm  離 心 10 分鐘後去除上清液後,再加入 1 mL 的 75% EtOH 於 4C,12,000 rpm 離心 10 分鐘 後小心去除上清液,將白色沉澱物(pellet)風 乾至半透明後加入 20 μL DEPC 處理水回溶 沉澱物,將樣本置於冰上以測定 EV 71 濃度。

反轉錄-即時眾合 鏈反應(quantitative reverse transcription  PCR,  qRT-PCR)反轉錄

PCR (reverse transcription-PCR,RT-PCR)[9]:

將萃取出之 EV  71  RNA 以 20μL DEPC 處理水 20 倍稀釋,使用超微量分 光光度計(ND-1000, NanoDrop Spectrophotometer) 測量其濃度。然後根據測得的濃度,加入 1 μg 濃度 RNA、2 μL 10x RT buffer、0.8 μL 25x  dNTP  Mix  (100  mM)、2  μL  10x  RTrandom primers、1 μL MultiScribeTM reverse transcriptase 及 1 μL RNase inhibitor 之後補ddH2O 至總體積 20 μL,再以 25C保持 10 分鐘、37C保持 120 分鐘、最後 85C保持 5 分 鐘的順序循環 1 次,進行 RT-PCR。

qPCR   之操作流程[10]:將萃取出的   EV 71 RNA 進行反轉錄聚合醋鏈反應,得到的 cDNA 後進行 qRT-PCR 檢測。取 5 μL cDNA、0.5 μL Forward primer (30 M)、0.5 μL Reverse primer (30   M)、25 μL FastStart Universal SYBR Green Master 及 19 μL ddH2O 置 入 StepOnePlusTM real-time-PCR 儀 器 (Thermo Fisher  Scientific  公司,美國)中 擴增 40 次進行量測,利用 StepOnePlusTM 之 內建軟體進行螢光偵測,再將偵測到的訊號 轉換為數值,並以 GAPDH 為內部控製組, 將各組待測基因之 CT 值標準化以取得企CT 值,而後實驗組扣除控製組之企CT   值,得到企企CT。2-企企CT   則可表示不同組別之待測基因與控製組之基因相對表現量。

         Primer: EV 71 RNA Positive  strand

         F:   (GAGAGTTCTATAGGGGACAGT)

         R:  (AGCTGTGCTATGTGAATTAGGAA) Negative  strand

         F:   (ACTGTCCCCTATAGAACTCTC)  

         R:  (TTCCTAATTCACATAGCACAGCT)


VTM I-VTM 的效能評估

效能評估時,將 EV 71 分別與 VTM 或 I- VTM 混合,然後保存在 3 種溫度,在不同保 存時間後接種 RD 細胞, 觀察 EV 71 的活性 (有能力產生 CPE)以及偵測核酸的存在(能被 qRT-PCR 方法檢出)。根據 CLSI M40-A2 建 議的病毒檢體運送裝置評估標準[6],本研究使 用的 EV 71 原液濃度為 1x106 PFU/mL,在 保存型 VTM 組別中將培養基中病毒濃度稀釋 至 2x105 PFU/mL,取 0.2 mL 病毒加入 2 mL VTM 中(約  1.8x104     PFU/mL);另外 I-VTM 組別,取 50 L 病毒與 50 L I-VTM 混合後 放入離心管中   (約 5x105     PFU/mL)。個別在4C、-80C及室溫存放。由於在台灣,交通 運送便利且距離較近,病毒檢體運送時間短, 且通常存放在 4C。所以在 4C組別中增加 6 小時及 24 小時兩個組別,以模擬病毒檢體實 際運送狀況。保存在 4C分為 6、24、48、72 及 96 小時共 5 組,而保存在-80C及室溫為48、72 及 96 小時共 3 組。此外,為了確認 I-VTM 裂解病毒的能力,額外將 EV 71 接種於 I-VTM 中存放 10 分鐘、30 分鐘、1、2、3 及 4 小時,然後接種 RD 細胞並觀察 CPE。

當 EV 71 接種至 VTM 存放至預設的時 間點後,VTM 組別分別取 0.2 mL(約 103 PFU)接種至 RD 細胞中,再加入 0.2 mL 2% MEM 進行混合,而 I-VTM 組別則取 40 L, 加至 9.96  mL  2%  MEM,稀釋後(約 2x103PFU/mL)取 1 mL(約 2x103  PFU)接種至RD 細胞中。隨後,將接種 EV 71 的 VTM 及I-VTM 組別分別放置於 37C之 5% CO2 培養 箱培養中,1 小時後,移除細胞培養液,以 1x PBS 潤洗過後,再加入 2% MEM,然後 分別培養 48 及 72 小時,最後以倒立式顯微 鏡觀察 CPE。同時,將隻加入 VTM 或 I-VTM 作為保存液之 RD 細胞及含有 2% MEM 的 RD 細胞分別作為陰性控製組。培養至指定時間 後,分別觀察 RD 細胞的 CPE 及操作 qRT- PCR 以分析 VTM 或 I-VTM 的效能。


VTM I-VTM 保存 EV 71 SARS-CoV-2

核酸的測試

為了確認 EV 71 與 SARS-CoV-2 的 RNA 可以直接保存在 VTM/I-VTM 中,本研究分 別取 1 L EV 71 (1x106 PFU/mL) 加至 1 mL VTM 或 I-VTM 中(約 1x103    PFU/mL),以及取 10 uL SARS-CoV-2 檢測所用的 E、 RdRp 及 N 基因片段之混和庫存液(mix stock),分別保存在 4C、-80C及室溫,然後存放至24 及 96 小時,最後再抽取兩種病毒之核酸進行 qPCR 檢測。


結    果


在不同溫度及時間下 VTM 保存 EV 71 活性與 核酸的狀況

本研究將 EV 71 保存於 VTM 中,然後 於特定的時間點時移種至 RD 細胞中進行培 養,經過 72 小時後觀察細胞形態,並與未接 種 EV 71 之 RD 細胞進行比較。相較於控製 組,無論在 4C、室溫及-80C,RD 細胞皆 呈現皺縮、變圓、出現空泡、凝聚、和脫落 等現象(圖 2A),此結果顯示 RD 細胞發生 CPE(表 1),代表 EV 71 具有活性。另外, qRT-PCR 檢測 RD 細胞內 EV 71 之正股與負 股 RNA 片段,結果皆呈現陽性(表 1),此 指出 VTM 可良好保存病毒之核酸。

在不同溫度及時間下 I-VTM 去除 EV 71 活性 與保存 EV  71 核酸的狀況

本研究將 EV 71 保存於 VTM 中,然後 於特定的時間點時移種至 RD 細胞中進行培 養,經過 72 小時後觀察細胞形態,並與未接 種 EV 71 之 RD 細胞進行比較。結果顯示在 4C、室溫及-80C細胞皆無 CPE(圖 2B)。 同時利用 qRT-PCR 檢測細胞內 EV 71 正股及

負股 RNA 片段,觀察細胞內病毒核酸保存情形,結果皆呈現陰性(表 1),顯示 I-VTM 可以去除病毒活性(感染力)。同時觀察將 EV 71 保存於 I-VTM 中於三種不同時間點 (4C、 室溫及 -80C)保存 10 分鐘、30 分 鐘、1、2、3 及 4 小時,結果顯示 4C及室溫 於 2 個小時可以完全去除 EV 71,而-80C僅 需 30 分鐘即可(表 2 與圖 3)。


VTM/I-VTM 在不同溫度及時間下保存 EV  71COVI-19 病毒核酸的狀況

在臨床檢驗中,由於檢體採集包含組織、 疲液、血液及糞便等不同樣本,為了確保 VTM 及 I-VTM 能直接保存核酸樣本,將 EV 71 與 SARS-CoV-2 檢測所用的 E、RdRp 及 N基因片段加入 VTM 及 I-VTM 中於 4C、室 溫及-80C各別保存 24 及 96 小時,利用 qRT- PCR 檢測 EV 71 核酸及 SARS-CoV-2 基因的 訊號。結果顯示 VTM 及 I-VTM 至少可保存 病毒核酸至 96 小時(表 3)。

 

討    論


自患者檢體中分離病毒的方法為病毒疾 病診斷法之一。含有液體的檢體,例如腦脊 髓液、尿液、及糞便檢體可直接置於無菌的 容器中送到病毒檢驗室。必須以拭子採集的 檢體如喉嚨、鼻咽、直腸等,則須將採集檢 體後的拭子立刻放入無菌的運送培養基中。 病毒檢體運送培養基至少具有三個功能[11]: (i)提供給水分,防止乾燥將病毒去活化(inac- tivated)。(ii) 含 有 蛋 白 質 穩 定 劑 (protein stabilizer) 以保持拭子上病毒的活性。以及 (iii)含有抗生素而可抑製採檢時受到採檢部 位棲息細菌和其菌的汙染。無論是否使用運 送培養基裝置,所有的檢體須立刻送到檢驗 室,因為病毒在活細胞外十分不穩定。

冠狀病毒中 SARS-CoV 與 SARS-CoV-2 都是屬於傳染力極強的飛沫傳染病毒,感染 者都會伴隨著嚴重的呼吸道症狀及高致死率 前者於 2002-2003 共造成全球 8,096 例感染, 其中 774 例死亡,致死率為  9.56%;而後者 於 2019-2020/9 月中共造成全球 3,131 萬人感 染,其中 96.6 萬人死亡,致死率為 3.09% [12],且兩種病毒有最長 10 及 14 天的高感染 力潛伏期。麵對傳播如此快速又高致死率的 病毒,臨床上有效且安全地篩檢 COVID-19 確診患者將是一項重大的考驗。

病毒的聚合醋 鏈反應 (PCR)檢測,不能 含有外來的 DNA/RNA 及 DNases/RNases, 但棉拭和海藻酸鹽棉拭均存在這些醋,將會 抑製 PCR 反應[3]。VTM 或 I-VTM 所附帶的 拭子均為植絨的吸頭,其為聚瞌胺的一種, 植絨纖維束間的毛細管作用促進了液體樣品

(A) CMPTM 病毒運送保存管[viral transport medium (VTM,左方橘色培養液)]與 CMPTM 去活化型病毒運送保存 管[inactivated viral transport medium (I-VTM,右方透明培養液)],兩者皆可搭配鼻咽及/或口咽植絨拭子(flocked swab);(B)由上到下分別為 nasopharyngeal flocked swab(鼻咽植絨拭子)、oropharyngeal flocked swab(口咽植 絨拭子)及一般人造絲棉棒。植絨拭子皆具有斷點(紅色箭頭處),可將拭子前端折進運送管內。


表 1. EV 71 分別接種於 VTM 或 I-VTM 中在不同溫度及儲存時間下對 RD 細胞產生 CPE 及 RD

細胞內核酸檢測結果

於存溫度/於存時間

Control(控製組)

4C

RT

-80C

Medium only

EV 71 only

6 hr

24 hr

48 hr

72 hr

96 hr

48 hr

72 hr

96 hr

48 hr

72 hr

96 hr

測試產品

VTM

CPEa

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Positive strandb

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Negative strandC

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

測試產品

I-VTM

CPEa

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Positive strandb

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Negative strandC

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

aCPE: +,代表 RD 細胞產生細胞病變 (CPE); -,代表 RD 細胞無 CPE;bPositive strand: +,表示樣品中含有 EV 71 顆粒。-, 表示樣品中無 EV 71 顆粒;CNegative strand: +,代表 EV 71 核酸進行複製; -,代表 EV 71 核酸無進行複製。 縮寫:VTM,病毒運送保存管;I-VTM  去活化型病毒運送保存管;RT,室溫。

的強力吸收,且將樣品吸附在靠近表麵的位 置,因此,易再溶於液體中。因此,植絨拭 子可有效收集和釋放包括細胞在內的顆粒物 [13],適合採檢含有病毒的檢體[1-3]。適當的運 送培養基的組成對保護檢體中病毒免受環境損傷,維持病毒活性極其重要[11]。實際上,病毒的傳染性會隨著時間的流逝而降低,且衰減率通常與於存溫度有關[14],藉由冷藏可 維持其核酸穩定性。採集含有較多病毒顆粒 的細胞培養物及縮短病毒檢體的運送與接種 時間,將會增加成功分離病毒的可能性,此 對高危險性傳染病毒的精準診斷將有所助益。

本研究將 EV 71 保存於 VTM 中,結果發現無論是 4C、室溫及-80C保存於指定時間點




  圖 2. EV 71 分別接種於 VTM 或 I-VTM 中在不同溫度及時間財存後戚染 RD 細胞所顯示的細胞形態

圖中包括含陽性控製組(PC: virus)、陰性控製組(NC: medium)與實驗組(4C、RT 及-80C)之細胞形態。顯微鏡 (200x)觀察。(A) VTM 的陰性控製組顯示細胞完整,無細胞病變(CPE);陽性控製組與實驗組在所有溫度及時間下 皆發現 CPE:細胞呈現皺縮、變圓、出現空泡、凝聚、和脫落等現象(箭頭)。(B) I-VTM 的陰性控製組與實驗組 細胞皆無 CPE,而陽性控製組則有 CPE。

縮寫:VTM,病毒運送保存管;I-VTM   去活化型病毒運送保存管;RT,室溫。

後(最久 96 小時)接種於 RD 細胞,結果顯 示 RD 細胞皆呈現 CPE;此外,檢測細胞內正股及負股 RNA 亦皆呈現陽性,顯示 VTM 可

以良好保存病毒活性(表 1  和圖  2A)。當 EV 71 保存於 I-VTM 中,無論是 4C、室溫及-80C 保存於指定時間點後接種於 RD 細胞,結果顯 示細胞皆無呈現 CPE,細胞內的 EV 71 正股及 負股 RNA 亦皆呈現陰性(表 1 與圖 2B),此 指出 EV 71 喪失活性。另外研究亦指出 I-VTM 可於 2 小時完整的去除 EV 71 活性(表 2 和圖 3)。此外,將 EV   71 與 SARS-CoV-2 的片段



表 2.  接種 EV 71 於 I-VTM 在不同溫度下時 存不同時間裂解病毒(不產生  CPE)的效能

時間

溫度

10 min

30 min

1 hr

2 hr

3 hr

4 hr

4C

+*

+

+

-

-

-

RT

+

+

+

-

-

-

-80C

+

-

-

-

-

-

*+,表示接種到 RD 細胞後於 72 小時內出現細胞病變

(CPE);-,表示未出現 CPE。

縮寫:I-VTM  去活化型病毒運送保存管;RT,室溫。


圖 3. 接種 EV 71 於 I-VTM 中儲存不同溫度 及不同時間後分別移種 RD 細胞所顯示 EV 71 不產生 CPE(喪失活性)的情形

圖中包括含陽性控製組 (PC: virus)、陰性控製組 (NC: medium)與實驗組 (4C、RT 及-80C)之細胞形態。顯 微鏡 (200x)觀察,箭頭代表產生 CPE 細胞。結果顯示 控製組細胞完整無 CPE,而實驗組中於存在-80C,1 小時後以及於存在 4C及 RT(室溫),2 小時後完全 無 CPE(代表 EV  71 喪失活性)。

縮寫:I-VTM 去活化型病毒運送保存管;RT,室溫。

表 3.  VTM 與 I-VTM 在不同溫度下保存 EV  71 及 SARS-CoV 2 核酸情形

時間

溫度

EV 71 RNA

SARS-CoV 2 基因片段

(E gene、RdRp gene N gene)

VTM

I-VTM

VTM

I-VTM

4C

24 hr

96 hr

24 hr

96 hr

24 hr

96 hr

24 hr

96 hr

4C

+

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RT

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-80C

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+,表示樣品中含 EV 71 或 SARS-CoV-2 核酸,可被 qRT-PCR 檢出。

縮寫:VTM,病毒運送保存管;I-VTM   去活化型病毒運送保存管;RT,室溫。

基因直接加入 VTM/I-VTM 中於 4C、室溫 及-80C保存 24 及 96 小時,然後進行兩種病 毒的核酸偵測,結果皆為陽性,指出   VTM/I-

VTM 皆可完整保存病毒的核酸(表 3)。

上述結果顯示 VTM 或 I-VTM 不論在 4C、室溫及-80C皆可以在指定時間內有效 保存病毒的可檢測性,其中 VTM 為保存型 運送管,可以完整保存病毒的活性,以利後續的體外活體細胞培養、抗原檢測、核酸檢測.等鑑定及研究用途,而 I-VTM 的特點則 在於運送過程中(2 小時)即可裂解病毒顆 粒,僅保存核酸供作核酸檢測,而不具感染 能力,其設計目的為增加臨床第一線檢測人 員的安全,降低感染風險。根據本研究所獲 得的數據顯示,做新生物科技有限公司生產 的 VTM 及 I-VTM 可做為臨床檢驗室選用病 毒檢體運送裝置的參考。